화학물질의 세포 독성 평가를 위한 MTT Assay

1. 서론

MTT Assay는 세포 생존율 및 독성을 평가하는데 널리 사용되는 실험법 중 하나입니다. 이 방법은 다양한 화학물질, 약물, 환경 유해 물질 등이 세포에 미치는 영향을 분석하는 데 유용합니다. 특히, MTT Assay는 세포 독성 연구에서 기본적이면서도 필수적인 도구로 자리 잡고 있으며, 그 신뢰성과 재현성 덕분에 많은 연구에서 활용되고 있습니다. 본 글에서는 MTT Assay의 원리, 실험 절차, 결과 분석 및 장점과 한계에 대해 다루어 보겠습니다.

세포의 모습

2. MTT Assay의 원리

MTT Assay의 기본 원리는 살아있는 세포에서 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)라는 황색의 테트라졸리움 염이 세포 내 미토콘드리아에 의해 보라색의 불용성 포마잔 결정체로 환원되는 것에 기반을 두고 있습니다. 미토콘드리아의 탈수소효소는 살아있는 세포에서만 활발히 작용하므로, MTT를 포마잔으로 변환하는 능력은 세포의 생존 여부를 간접적으로 반영합니다. 환원된 포마잔 결정체는 용해 후 흡광도(Optical Density, OD)로 측정되며, 이 값은 세포 생존율과 직접적으로 비례합니다.

MTT Assay에서 사용되는 기본적인 시약은 MTT와 이를 용해시키는 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide) 또는 이소프로판올입니다. 세포가 MTT를 환원시키는 능력은 세포의 대사 활성도를 반영하며, 따라서 흡광도가 높을수록 세포 생존율이 높다는 것을 의미합니다.

MTT assay 원리 (출처 10.13040/IJPSR.0975-8232.12(3).1685-98)

3. 실험 절차

MTT Assay를 수행하는 절차는 비교적 간단하며, 다음과 같은 단계를 거칩니다.

1. 세포 배양: 실험에 사용할 세포를 96웰 플레이트에 배양합니다. 이때 각 웰에 배양되는 세포 수는 실험 목적에 따라 다르지만, 보통 한 웰당 1×10^4에서 1×10^5개의 세포를 사용합니다. 세포가 플레이트에서 충분히 부착되고 증식할 수 있도록 24시간에서 48시간 동안 배양합니다.
2. 화학물질 처리: 배양된 세포에 실험하고자 하는 화학물질을 농도별로 처리합니다. 이때 음성 대조군(화학물질 처리 없음)과 양성 대조군(알려진 독성 물질 처리)을 포함시켜 실험의 신뢰성을 높입니다. 일반적으로 화학물질 처리 후 24시간에서 72시간 동안 세포를 배양합니다.
3. MTT 첨가: 세포 배양 후, 각 웰에 MTT 용액을 첨가합니다. MTT의 최종 농도는 보통 0.5 mg/mL로 설정되며, MTT는 세포에 3~4시간 동안 처리됩니다. 이 기간 동안 살아있는 세포는 MTT를 환원하여 보라색 포마잔 결정체를 형성합니다.
4. 포마잔 용해 및 흡광도 측정: MTT 처리 후, 세포 배양액을 제거하고, 각 웰에 DMSO 또는 이소프로판올을 첨가하여 포마잔 결정체를 용해시킵니다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 사용해 570 nm에서 흡광도를 측정합니다. 흡광도가 높을수록 해당 농도에서의 세포 생존율이 높음을 의미합니다.

4. 결과 분석

MTT Assay의 결과는 각 웰의 흡광도 값으로 나타납니다. 실험군의 흡광도 값을 음성 대조군의 값과 비교하여 상대적인 세포 생존율을 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 농도의 화학물질이 처리된 세포에서의 흡광도가 대조군에 비해 절반 수준이라면, 그 농도에서의 세포 생존율은 50%로 간주됩니다. 이 결과는 독성 평가에서 중요한 지표로 사용되며, 화학물질의 독성 강도를 평가하는 데 유용합니다.

또한, 다양한 농도의 화학물질을 처리한 후 IC50(반 최대 억제 농도)을 도출할 수 있습니다. IC50 값은 세포 생존율을 50%로 감소시키는 화학물질의 농도로, 특정 화학물질의 독성을 정량적으로 비교하는 데 활용됩니다.

MTT assay 결과 이미지 (출처 AAT Bioquest)

5. MTT Assay의 장점과 한계

MTT Assay는 간편한 절차와 높은 재현성, 다양한 세포 유형에 적용 가능하다는 점에서 많은 연구자들에게 선호되는 방법입니다. 특히, 실험이 비교적 짧은 시간 내에 완료될 수 있고, 소량의 시약으로도 충분한 데이터를 얻을 수 있어 비용 효율적입니다.

그러나 몇 가지 한계점도 존재합니다. MTT Assay는 세포의 미토콘드리아 기능에 크게 의존하기 때문에, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포나 특정 조건에서 정확한 결과를 얻기 어려울 수 있습니다. 또한, 일부 세포주에서는 포마잔 결정체가 완전히 용해되지 않거나, 비특이적 흡광도가 나타날 수 있어 결과 해석에 주의가 필요합니다. 이러한 문제는 MTT Assay를 보완할 수 있는 다른 세포 생존율 측정 방법과 병행함으로써 극복할 수 있습니다.

6. 결론

MTT Assay는 독성학 연구에서 필수적인 도구로, 다양한 화학물질의 세포 독성을 평가하는 데 매우 유용합니다. 이 방법은 신속하고 재현 가능한 결과를 제공하며, 실험 조건에 맞춰 유연하게 적용할 수 있습니다. MTT Assay의 몇 가지 한계점에도 불구하고, 이 방법은 여전히 독성 평가와 관련된 연구에서 널리 사용되고 있습니다. 앞으로도 MTT Assay는 새로운 화학물질 및 약물의 독성 평가에 중요한 역할을 할 것으로 기대됩니다.

이와 같이 MTT Assay는 세포 생존율을 평가하는 데 있어 중요한 실험법이며, 이를 통해 다양한 화학물질의 독성을 정량적으로 분석할 수 있습니다. 실험적 응용 가능성이 높은 만큼, 연구자들이 MTT Assay를 적절히 활용하여 독성 평가 연구에 기여할 수 있을 것입니다.